學會會訊
雖然顱內動脈瘤破裂後蜘蛛膜下腔出血引發的腦血管痙攣已被發現超過半世紀，但仍是這類病人死亡及發生併發症的主要原因，其機轉與適當的治療仍未明。不同於其它類的中風，顱內動脈瘤較常發生於女性，而性別的差異與女性賀爾蒙對預後的影響仍未有定論。dentate gyrus中granule cell的細胞凋亡(apoptosis)在蜘蛛膜下腔出血動物與病人皆被發現。細胞凋零可能是蜘蛛膜下腔出血引發腦血管痙攣的原因，也與這類病人長期預後有關。我們先前的研究發現17β-estradiol (E2)經由全身持續性給予，於生理劑量可有效預防雄性大鼠在蜘蛛膜下腔出血後的腦血管痙攣，而此預防效果可能部分是因E2可防止蜘蛛膜下腔出血後iNOS的表現及保留eNOS的表現，及減低內皮素-1(endothelin-1)的製造有關，我們更進一步發現E2可經由女性賀爾蒙接受器(estrogen receptor)機轉，而在dentate gyrus有抗凋亡的作用。而防止蜘蛛膜下腔出血後iNOS的表現，證實是經由estrogen receptorα(ERα)抑制NF-κB之活化。我們也發現腺苷酸A1接受器及腺苷酸A2A接受器催動劑可以減緩蜘蛛膜下腔出血後的腦血管痙攣與續發性腦損傷，但腺苷酸A1接受器催動劑無法完成回復腦血管痙攣，可能是因其只能抑制蜘蛛膜下腔出血後iNOS的增加，而無法如E2與腺苷酸A2a接受器催動劑可以回復eNOS的減少。
E2經由基因與非基因機轉透過製造NO、cGMP、cAMP、adenosine與 prostacycline，與改變離子通道活性使得血管擴張。求偶素類在心血管的角色可在停經前的女性看出來，這類女性比男性有較低心血管疾病的危險。在停經後女性使用求偶素類治療可有效減少冠狀動脈疾病。在大鼠蜘蛛膜下腔出血模式，發現求偶素類可以降低蜘蛛膜下腔出血引起之續發性腦缺血損傷及死亡率。E2也被證實在腦神經退化疾病與腦損傷有神經保護作用。在動物實驗也發現E2可減少局部或整體腦缺血後的神經死亡。臨床上以E2治療停經後婦女，可減少中風機率、腦缺血神經退化的程度及Alzheimer disease的發作與嚴重程度。
Akt經由抑制細胞凋亡在細胞存活的路徑上扮演重要角色，它經由磷酸化Ser473而活化，是PI3-K途徑的下游，初始時，PI3-K負責將Akt招募到細胞膜及活化Akt。PI3-K活化後引發Akt磷酸化，接著磷酸化及阻斷BAD (Bcl-2家族中proapoptotic member) 的作用，此外，PI3-K也改變其它proapoptotic member mediator，包括caspase-9、forkhead及NF-κB。甚者，活化的Akt也磷酸化與抑制其下游物，如GSK3β經由促進細胞存活與抑制細胞凋亡，導致神經細胞抵抗凋亡的刺激。最近，Akt途徑在腦缺血、創傷性腦損傷、脊髓損傷及蜘蛛膜下腔出血被證實參與神經細胞凋亡的機轉。
然而Akt在細胞存活路徑抗凋亡的角色於E2保護腦損傷上仍未被研究。本研究主在釐清
材料與方法
動物準備
所有的實驗步驟皆經高雄醫學大學動物管理委員會的認可。Sprague-Dawley公鼠體重338至389克，隨機平分成以下7組
引發實驗性蜘蛛膜下腔出血
兩次出血的實驗性蜘蛛膜下腔出血用來作為本研究的方法，動物以腹腔內注射pentobarbital（50mg/μg）麻醉，動物的肛溫以熱墊（Harvard Apparatus, Holliston, MA）維持在36±1℃，尾動脈以polyethylene導管插管監測血壓及心跳。以25號蝴蝶針直接經皮穿刺到腦大孔池，慢慢地抽出約0.1至0.15毫升的腦脊髓液，在蝴蝶針頭與管子的交接處夾住，從尾動脈抽出0.3毫升無加heparin的自體血，使用針頭刺入針頭方法（經針頭與管子的交接處，把30號針頭刺入25號蝴蝶針）， 將血慢慢打入腦大孔池。48小時後，同樣的步驟再實行一次。因此，本實驗之蜘蛛膜下腔出血被定義為兩次出血之蜘蛛膜下腔出血模式，為將血兩次打入腦大孔池。第一次蜘蛛膜下腔出血後7天，動物灌流犧牲，將腦取下儲藏於-80℃下。
細胞死亡檢驗(cell death assay)
各分組各取6隻動物，以enzyme immunoassay 檢查DNA fragmentation代表細胞死亡。將動物腦分成cortex、hippocampus( CA1，CA2與CA3)及dentate gyrus.
Western blot分析caspase-3之活性與ERα與phosphor-Akt
各分組取6隻動物，將腦依上述分區取蛋白質，以colorimetric assay kit測caspase-3之活性，以western blot analysis測ERα與phosphor-Akt。
統計分析
數據以平均值±標準差來表示，再以one-way analysis of variance（ANOVA）分析及Scheffe post hoc test。P值小於0.05當為有意義。
結果
大體外觀上之觀察
在灌注固定之前，正常控制組與治療組其生理測量數據都有記錄，包括體重、動脈血中酸鹼度與血氧、血中二氧化碳濃度、平均動脈壓及心血，皆無有意義的差別。
E2在蜘蛛膜下腔出血後於dentate gyrus有抗細胞凋亡作用為經由活化ERα
蜘蛛膜下腔出血後在cortex與hippocampus沒有明顯的DNA fragmentation，但在dental gyrus有明顯細胞凋亡。而在E2治療組，E2可有效減少其細胞凋亡，但以ICI 182,782與MMP給予的動物，E2之抗細胞亡凋作用被回覆，而R,R-THC給予的動物，E2之抗細胞亡凋作用不被回覆，顯示E2之抗細胞亡凋作用，是經由活化ERα，非ERβ。
E2預防蜘蛛膜下腔出血引發細胞凋亡是經由減少caspase-3之活性
蜘蛛膜下腔出血引發caspase-3之活性在dentate gyrus有統計學上意義之上升，而E2治療可回復之,，但在caspase-3之活性於cortex與hippocampus則在蜘蛛膜下腔出血後無顯著改變。但以ICI 182,782與MMP給予的動物，E2抗caspase-3之活性作用被回復，而R,R-THC給予的動物，E2抗caspase-3之活性作用不被回復，顯示E2抗caspase-3之活性作用，是經由活化ERα，非ERβ。
E2可回復蜘蛛膜下腔出血引發dentate gyrus之phospho-Akt蛋白質與ERα之表現，而ERβ沒改變
蜘蛛膜下腔出血後在cortex與hippocampus之phospho-Akt蛋白質與ERα、ERβ沒有明顯的改變，但在dental gyrus之phospho-Akt蛋白質與ERα有明顯的減少，而ERβ沒有明顯的改變。在E2治療組，E2可有效回復phospho-Akt蛋白質與ERα之表現。但以ICI 182,782與MMP給予的動物，E2回復phospho-Akt蛋白質與ERα之作用被回復，而R,R-THC給予的動物，E2回復phospho-Akt蛋白質與ERα之作用不被回復，顯示E2回復phospho-Akt蛋白質與ERα之作用，是經由活化ERα，非ERβ。
討論
認知功能障礙是蜘蛛膜下腔出血後常見的後遺症，細胞凋亡被指出與蜘蛛膜下腔出血後急性腦損傷有關，再者蜘蛛膜下腔出血的病人其dentate gyrus有細胞凋亡的情形，這些都顯示可以抗細胞凋亡來治療蜘蛛膜下腔出血後的腦二度損傷。在不同的蜘蛛膜下腔出血動物模式及細胞實驗，蜘蛛膜下腔出血引發的細胞凋亡程度與部位也不同，在蜘蛛膜下腔出血後不同時間檢測也有不同的結果，其可能的機轉也不一樣，如顱內壓上昇、急性全腦缺血、延遲性腦缺血、急性腦血流減少及血色素之代謝。一些細胞凋亡途徑被指出與蜘蛛膜下腔出血的細胞凋亡有關。Akt途徑在神經退化疾病是其中一種細胞凋亡途徑，然而只有少數論文提及與蜘蛛膜下腔出血有關，如phospho-Akt與GSK3β的表現時程與分佈與蜘蛛膜下腔出血引發的腦損傷有關。研究指出，simvastatin與recombinant erythropoietin活化Akt/GSK3β的存活訊號途徑可改善蜘蛛膜下腔出血後的細胞凋亡。 我們的研究結果也指出蜘蛛膜下腔出血後，phospho-Akt下降，但E2可以逆轉之，更證明Akt在蜘蛛膜下腔出血後有的血管痙攣與細胞凋亡伴演重要角色。
本研究也證實ERα參與E2治療蜘蛛膜下腔出血引發之細胞凋亡，E2在其它細胞與動物實驗也被證明有神經保護作用，其機轉可為接受器依賴與非依賴二者。E2抗細胞凋亡的機轉可能為抑制proapoptotic protein與增加antiapoptotic protein，抑制tumor neurosis factor基因之轉錄，減少TNF-mediated cytokine之釋放。本研究發現，E2在蜘蛛膜下腔出血後對細胞凋亡的保護作用，為經由ERα在dentate gyrus改變caspase-3蛋白質的表現，我們也發現此作用為E2經由ERα活化phospho-Akt與ERα。我們先前的研究指出E2可經由ER依賴之機轉增加腺苷酸A2A接受器與ERK之表現來滅少蜘蛛膜下腔出血後的細胞凋亡與血管痙攣。ERK與Akt之交作用，仍需進一步研究。在cortex及hippocampus中phospho-Akt、ERα、ERβ、caspase-3及DNA fragmentation在蜘蛛膜下腔出血後，有無E2治療皆無改變。
E2可在神經受損後活化Akt，但未受損部位並無法活化，其一發現與其它研究相同，我們發現蜘蛛膜下腔出血後，phospho-Akt與ERα蛋白質表現在dentate gyrus皆下降，二者蛋白質可能參與蜘蛛膜下腔出血後的細胞凋亡，E2在治療與預防蜘蛛膜下腔出血後的胞凋亡，需進一步探討，以期提供蜘蛛膜下腔出血病人之臨床治療。
參考文獻
