目的
目前，臨床上診斷急性缺血性腦中風並無實用之生物標記。基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)被廣泛地使用來分析生物分子如蛋白質。這項技術被認為在分析系統性疾病如動脈硬化或腦中風等有很高的價值。本研究的目的即在於以基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀來確認有潛力作為診斷急性缺血性腦中風生物標記之胜肽和蛋白質。

方法
我們從47位急性缺血性腦中風患者和34位對照組受試者取得血清樣本並進行基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀分析，並同時登錄腦中風患者的美國國家衛生研究院腦中風評估量表(NIHSS)分數、TOAST亞型分類、失能量表(mRS)、腦梗塞體積、危險因子與生化檢驗數據以進行比對。基質輔助雷射脫附游離質譜儀之基質4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid (α-CHC)和sinapinic acid (SA)由Aldrich (Milwaukee, WI, USA)購得，而2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5-DHB)則由KASEI (Trade Mark, TCI, Tokyo)購得。高效液相層析儀等級溶劑(HPLC-grade solvents, Aldrich)在沒有更進一步純化的情況下用來製備樣本。

血清樣本5ml二次蒸餾水(double distilled water)稀釋五次，再與基質溶液(SA)以相同體積(1μL)在基質輔助雷射脫附游離質譜儀之托盤上混合。當沈積在托盤上之樣本/基質混合溶液自然風乾後，將托盤送入基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(Autoflex, Bruker Daltonics, Germany)之離子源。再以脈衝式氮氣雷射(pulsed nitrogen laser, 337 nm) 照射樣本來造成脫附與游離。每份樣本大約平均以300發雷射來取得具代表性的質譜。

所有的正離子質譜均在加速電壓20kV、線性模式下取得。為了排除基質和其他小分子所造成的干擾，離子質荷比(m/z)在500以下的訊號均被抑制。基質輔助雷射脫附游離質譜的外在校正則以胰島素、人類血紅蛋白和肌紅蛋白作為標準。

結果
研究對象總共有47名急性缺血性腦中風患者(平均年齡為69.87 ± 11.2歲)，其中27名為男性，20名為女性。共有34名對照組受試者(平均年齡為52.41 ± 15.2歲)，14名為男性，20名為女性。基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀分析血清樣本後顯示，血清游離血紅蛋白之α 與β鏈波峰在急性缺血性腦中風患者和對照組之間有顯著不同的表現(P <0.0001) ，在個33 (70.2%)急性缺血性腦中風患者和5個 (14.7%)對照組受試者有偵測到血紅蛋白的波峰。作為一個診斷急性缺血性腦中風之生物標記，血清游離血紅蛋白有70.2%的敏感性和85.3%的特異性。在缺血性腦中風患者之中，血清游離血紅蛋白與NIHSS分數、TOAST亞型分類、mRS、腦梗塞體積、危險因子、生化檢驗數據等均未達到統計上顯著之相關。

討論

根據之前的研究，血清游離血紅蛋白被認為可能和缺血性腦中風與血管硬化有關聯[1-5]。血清游離血紅蛋白一旦從紅血球釋出後，就會因其氧化特性與分解後的產物血基質(Heme)而變得具有高度的毒性[1]。這些具有毒性的血清游離血紅蛋白會活化血管內皮細胞並造成發炎與血液凝集。除此之外血清游離血紅蛋白還具有其他有害血管的各種特性。之前有研究認為鎌刀型貧血症之所以會常常造成缺血性腦中風便是因為游離血紅蛋白的毒性所造成的[2]，主要是因為游離血紅蛋白會清除對於維持血管恆定和血管擴張很重要的一氧化氮而造成血管收縮和血管傷害[2,4]。該研究指出，只要可以降低游離血紅蛋白，便可降低中風發生的機會。

另外，如同文獻回顧中所提到的，血紅蛋白也被認為與動脈硬化形成的過程有關[1,3,5]。然而，在我們的研究中卻找不到血紅蛋白與動脈硬化相關的證據。血清游離血紅蛋白的表現與動脈硬化的危險因子包括年齡、性別、高血壓、糖尿病和血脂肪異常等均無統計上顯著之相關。

我們的研究也顯示出血清游離血紅蛋白與美國國家衛生研究院腦中風評估量表(NIHSS)分數(P=0.11)、梗塞體積(P=0.14)和梗塞位置(P=0.086)等未達統計上顯著之相關，但是仍具有低度相關。如果可以增加急性缺血性腦中風患者的樣本數，它們的低度相關可能會變顯著。因為這些相關有可能是反映出缺血性腦中風嚴重度和範圍的缺血性再灌流、氧化壓力和血塊負載(clot burden)所造成的結果。

至於缺血性腦中風與血清游離血紅蛋白的因果關係，從之前的文獻來看，似乎都有可能。不過以本研究的設計，並無法澄清兩者之間的因果關係。不過，如果以要作為診斷性生物標記的角度來看的話，應該以缺血性腦中風為因，血清游離血紅蛋白為果會比較理想。此外，在對照組仍有5個樣本(14.7%)其血清游離血紅蛋白呈現陽性。這樣的結果有可能是樣本製備上的瑕疵，或收案的對照組其本身的皮膚科疾病所引起，亦或是這樣的結果也暗示著這5位患者以後有較高的機會會發生缺血性腦中風，這些問題目前尚無法解答，需要未來作更多的研究來澄清。

參考文獻

1. Watanabe J, Chou KJ, Liao JC, Miao Y, Meng HH, Ge H, Grijalva V, Hama S, Kozak K, Buga G, Whitelegge JP, Lee TD, Farias-Eisner R, Navab M, Fogelman AM, Reddy ST (2007) Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem 282(32):23698-707.
2. Lezcano NE, Odo N, Kutlar A, Brambilla D, Adams RJ (2006) Regular transfusion lowers plasma free hemoglobin in children with sickle-cell disease at risk for stroke. Stroke 37(6):1424-6.
3. Buttari B, Profumo E, Petrone L, Pietraforte D, Siracusano A, Margutti P, Delunardo F, Ortona E, Minetti M, Salvati B, Riganò R (2007) Free hemoglobin: a dangerous signal for the immune system in patients with carotid atherosclerosis? Ann NY Acad Sci 1107:42-50.
4. Rother RP, Bell L, Hillmen P, Gladwin MT (2005) The clinical sequelae of intravascular hemolysis and extracellular plasma hemoglobin: a novel mechanism of human disease. JAMA 293(13):1653-62.
5. Na N, Ouyang J, Taes YE, Delanghe JR (2005) Serum free hemoglobin concentrations in healthy individuals are related to haptoglobin type. Clin Chem 51(9):1754-5.

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